猪瘟病毒（CSFV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：猪瘟病毒（CSFV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name ：Classical Swine Fever Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包装规格】50T/盒

【预期用途】 猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起猪的以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为 主要特征的一种高度接触性、致死性的传染病[1]，主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快， 发病率和病死 率高，给养猪业带来了巨大的经济损失[2]，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，被我 国农业部列为一类动物疫病，是危害我国养猪业最严重的动物疫病之一。 本试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中猪瘟病毒 RNA， 适用于猪瘟病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】 本试剂盒用一对猪瘟病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪瘟病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】 包装规格 50T/盒 CSFV 反应液 500μL×2 管 酶液 50μL×1 管 CSFV 阳性质控品 50μL ×1 管 阴性质控品 250μL ×1 管 说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。 【适用仪器】 ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】 病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血 5mL。

【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

【使用方法】 

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理 每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生 理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离 心管中；全血样品待血凝后取血清 100μL，置 1.5mL 离心管中。

1.1 核酸提取 推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照 试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管 数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 试剂 CSFV 反应液 酶液 用量 20μL 1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。

3. 加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短 暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区） 4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内； 4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 选择 None 即可。 4.3 推荐循环参数设置： 步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号 1 1 cycle 42℃ 20min 否 2 1 cycle 95℃ 10min 否 3 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定 5.1 结果分析条件设定 设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像 调节 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范围内调节）、stop 值（一般可在 5~20 范围内调节），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖动阈值线至高于阴性对照），重新分析结果。

5.2 结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线； 可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 3538 或无 Ct 值。

6. 质控标准 阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性 1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关； 2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果； 3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果； 4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果； 5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果； 6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果； 7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】 1.所有操作严格按照说明书进行； 2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心； 3.反应液应避光保存； 4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧； 5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服； 6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染； 7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器； 8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】 [1] Moennig V, Floegel-Niesmann G, Greiser-Wilke I. Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: review of new knowledge [J]. Vet J, 2003, 165（1）: 1-2. [2] Backer J A, Brouwer H, Schaik G, et al. Using mortality data for early detection of classical swine fever in the Netherlands [J]. Prev Vet Med, 2011, 99（1）: 38-47. [3] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 27540-2011 鉴猪瘟病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法