鱼类神经坏死病毒(VNN)核酸检测试剂盒说明书

鱼类神经坏死病毒(VNN)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

 【产品名称】

商品名称：鱼类神经坏死病毒(VNN)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

Name ：Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

鱼病毒性神经坏死病又称为病毒性脑病和视网膜病，是一种严重危害鱼类鱼苗的病毒性疾病。病原为病毒性神经坏死病毒（Viral nervous necrosis virus, VNNV）,属乙型野田村病毒属成员[1]。其临床症状为一系列与神经有关的异常表现。鱼苗具不正常的螺旋状或旋转式游动或静止时腹部朝上，一旦用手触碰病鱼，病鱼会立即游动等现象，鱼体体色异常苍白。不同种类的鱼临床症状不同，有的鱼苗会出现鳔过度膨胀，有的病鱼厌食、消瘦等。发病严重的鱼苗伴随着ji高的死亡率[1-2]。

本试剂盒适用于检测的鱼的脑、眼等标本中鱼类神经坏死病毒 RNA，适用于鱼类神经坏死病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对鱼类神经坏死病毒基因设计特异性的引物和探针[2-3]，用一步法荧光 RT-PCR 技术对鱼类神经坏死病毒RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

注：

1）  不同批号试剂不能混用。

2）  试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

取鱼类的脑和眼，鱼苗和较小的仔鱼取整条鱼。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标

本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.  样品处理（样本处理区）

1.1  样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中， 8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2  RNA 提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），

请按照试剂盒说明书进行操作。

2.  试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.  加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.  PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1  将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2  设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3  推荐循环参数设置：

5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2  结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤ 38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 陈爱平, 江育林, 钱冬, 等. 病毒性神经坏死病[J]. 中国水产, 2010.

[2] 中国农业部. SC/T 7216-2012 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)诊断技术规程[S]. [3]罗卫. 鱼类病毒性神经坏死病的病原学研究及检测方法的建立[J]. 华中农业大学, 2007.