谷氨酰胺合成酶（GS）试剂盒说明书

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书

                                       微量法 100管/48样

注   意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。

测定原理：

GS在ATP和Mg²⁺存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成的络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：10mL×1瓶，-20℃保存；临用前37℃预热20min，充分混匀，如有沉淀，静置10min，取上清待用。

试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；临用前37℃预热20min，充分混匀，如有沉淀，静置10min，取上清待用。

试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解待用。

试剂四：15mL×1瓶，4℃保存。

样本测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、   在EP管中加入下列试剂：

  混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴30min

混匀，25℃室温静置10min后，8000g，25℃离心10min，取200μL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，测定540nm处的吸光值A。△A=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

GS活力单位的计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.8348x + 0.0008，R² = 0.9999

1、血清（浆）GS活性

单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

计算公式：

GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷V样÷T

=10.268×ΔA

2、组织、细菌或细胞GS活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=10.268×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/g 鲜重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T

 =10.268×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h//10⁴ cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T

=0.021×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.3mL； V样：加入样本体积，0.07mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.4174x + 0.0008，R² = 0.9999

1、血清（浆）GS活性

单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

计算公式：

GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷V样÷T

=20.535×ΔA

2、组织、细菌或细胞GS活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=20.535×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/g 鲜重）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T

 =20.535×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/10⁴ cell）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T

 =0.041×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.3mL； V样：加入样本体积，0.07mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。