β-淀粉酶（β-amylase，β-AL）试剂盒说明书

β-淀粉酶（β-amylase，β-AL）试剂盒说明书

                                    微量法100管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

测定原理：

还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：30mL×1瓶，常温保存，若有黄色晶体析出，需90℃加热溶解后再用；

试剂二：15mL×1瓶，4℃保存，若出现沉淀析出，需70℃加热溶解后再用。

粗酶液提取：

组织：称取0.1~0.2g样本（建议称取约0.1g样本），加入1mL蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每5min振荡1次，使其充分提取；3000g，25℃离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10 mL，摇匀，即淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。

血清（浆）等液体样本：（1）直接检测α-淀粉酶。（2）吸取淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长到540 nm，蒸馏水调零。

2、试剂一和试剂二40℃预热10min.

3、测定操作表：

70℃水浴15min左右，冷却

  40℃恒温水浴中准确保温5min

混匀，95度水浴5min，冷却，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm处读取吸光值，从左到右分别记为A1、A2、A3和A4。每个测定管需设一个对照管。

酶活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归曲线为y=3.7215x -0.1778； x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、α‑淀粉酶活性

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T

=1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷（V样×Cpr）÷T

=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（浆）等液体样本中α‑淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T=0.1075×(A2-A1＋0.1778)

3、总淀粉酶活性计算

（1）按照样品质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(mg/min//g鲜重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷（V样×Cpr）÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（浆）等液体样本中总淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

总淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778)

4、β-淀粉酶活性计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A3＋0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（浆）等液体样本中β-淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mL）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)

5：总淀粉酶稀释倍数；V反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归曲线为y=2.481x -0.1778； x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、α‑淀粉酶活性

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷（V样×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（浆）等液体样本中α‑淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性（mg/min/mL）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778)

3、总淀粉酶活性计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T

=8.06×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反总]÷（V样×Cpr）÷T

=0.806×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（浆）等液体样本中总淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

总淀粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T

=0.806×(A4-A3＋0.1778)

4、β-淀粉酶活性计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[8.06×(A4-A3＋0.1778)-1.612×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（浆）等液体样本中β-淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mL）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)

5：总淀粉酶稀释倍数；V反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。