土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性测定试剂盒说明书

土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性测定试剂盒说明书

                                            微量法 100管/96样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GLS（EC 3.5.1.2）存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

测定原理：

S-GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、甲苯、冰和双蒸水。

试剂组成和配制：

试剂一×1瓶，15 mL，4 ℃保存；

试剂二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

试剂三×1瓶，60 mL，常温保存；

试剂四×1瓶，5 mL，常温保存；

试剂五×1瓶，3 mL，常温保存；

试剂六×1瓶，3 mL，常温避光保存。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。

2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：

混匀，37℃水浴2 小时

混匀，8000 g，25℃离心10 min；取上清液，依次加入下列试剂

混匀，室温静置15min，420nm处读取测定管和对照管吸光值，

计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

注意：试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。

酶活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 3.8488x+0.0057；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值A。

单位定义：每g土样每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

 S-GLS（nmol/min/g 土样）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反总÷W÷T=2.27×(ΔA -0.0057)÷W。

V反总：反应体系总体积：1.05mL；T：反应时间，2h=120min；W：样本质量，g; 1000，μmol到nmol换算系数。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 1.9244x+0.0057；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值A。

单位定义：每g土样每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

 S-GLS（nmol/min/g 土样）＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷W÷T=4.55×(ΔA -0.0057)÷W。

V反总：反应体系总体积：0.525mL；T：反应时间，2h=120min；W：样本质量，g; 1000，μmol到nmol换算系数。