谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）试剂盒说明书

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）试剂盒说明书

                                              微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。

测定原理：

GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体22mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加2 mL蒸馏水溶解。

粗酶液提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.  血清等液体：直接测定。

测定：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂三放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。

3. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL上清液，180μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光度变化，记录10 s和310 s吸光度为A1和A2。

GST活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=230×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/g 鲜重）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=230×(A2-A1)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/10⁴ cell）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=230×(A2-A1) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷V样÷T

                   = 230×(A2-A1)

ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³ L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议选用本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=460×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/g 鲜重）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=460×(A2-A1)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/10⁴ cell）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=460×(A2-A1)÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反总÷V样÷T

                   =460×(A2-A1)

ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³ L/mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议选用本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V

样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5min。

注意事项：

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；

2. 细胞中GST活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GST的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；

3. 本法测定GST活性的线性范围可达76 μmol/min /L，测定前先用1～2个样做预实验，如5min内反应不成线性，须对样品用蒸馏水稀释，计算结果乘以稀释倍数；

4. 测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在25℃或者37℃（哺乳动物）。