单胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）试剂盒使用方法

单胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）试剂盒说明书

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎动物的各种器官，特别是分泌腺、脑、肝脏，在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢，含量较低，具有重要的生理功能，其活性能反映肝纤维化的程度。此外，MAO活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转出现紊乱，从而引发多种病症。

测定原理：

MAO催化单胺类底物脱氨生成相应的醛，进一步氧化成酸；底物在360nm处有特征吸收峰，测定360nm光吸收下降的速率，计算MAO活性。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体2mL×1管，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.        称取约0.1g样品，加1 mL预冷的提取液一充分冰浴匀浆，1000g，4℃，离心10min，弃沉淀；把上清转移到另一预冷的离心管，10000g，4℃，离心30min，弃上清；加入1mL预冷的提取液二，震荡混匀，16000g，4℃，离心40min，弃上清；沉淀加入预冷的1mL 试剂一，震荡混匀，即粗酶液（可用于可溶性蛋白浓度测定）。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，弃沉淀；把上清转移到另一预冷的离心管，10000g，4℃，离心30min，弃上清；加入1.0 mL预冷的提取液二，震荡混匀，16000g，4℃，离心40min，弃上清；沉淀加入预冷的1.0 mL 试剂一，震荡混匀，即粗酶液（可用于可溶性蛋白浓度测定），取上清置于冰上待测。

3.        血清：直接测定。

测定操作表：

1、   分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至360nm。

2、   操作表

注意：空白管只需测定一次。

MAO活性计算公式：

a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、按蛋白含量计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每毫克蛋白质1min内转化1 nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反总÷（V样× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算：

酶活定义：37℃，pH7.6时，每克样品1min内转化1 nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min / g 鲜重）=×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T = 114×ΔA÷ W

3、按照细胞数量计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每104个细胞1min内转化1 nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T

= 114×ΔA÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每升血清1min内转化1 nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反总÷V样=114×ΔA

ε：底物摩尔消光系数，1460L /mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，60min，W：样本质量，g

b．用96孔板测定的计算公式如下

1、按蛋白含量计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每毫克蛋白质1min内转化1 nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反总÷（V样× Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算：

酶活定义：37℃，pH7.6时，每克样品1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min / g 鲜重）=×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照细胞数量计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每104个细胞1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T

= 228×ΔA÷细胞数量

4、   按照液体体积计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每升血清1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反总÷V样=228000×ΔA

ε：底物摩尔消光系数，1460L /mol /cm； d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，60min，W：样本质量，g

注意事项：

1、吸光度变化应该控制在0.01～0.8之间。否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

2、样品蛋白质含量需要另外测定。