木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）试剂盒说明书

木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）试剂盒说明书

         微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。

测定原理：

木质素过氧化物酶催化天青脱甲基，在651nm处测定吸光值减少。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、低温离心机、酶标仪、96孔板、可调式移液器、冰。

试剂组成和配制： 

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入115mL蒸馏水，充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存一个月。

试剂二：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体5mL×1支，4℃保存。

酶液提取：

1.        组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2.        细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3.        培养液或其它液体：直接检测。                        

测定操作：

1、酶标仪预热30min以上，调节波长至651nm。

2、临用前按每个样本试剂一：试剂二：试剂三=80:40:40（μL）的比例配制工作液，现配现用。

3、在96孔板中依次加入如下试剂

酶活计算公式：

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。

LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =250×ΔA÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。

LiP活性（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =250×ΔA÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。

LiP活性（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=0.5×ΔA

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。

LiP活性（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T =250×ΔA

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min