脱氢酶（dehydrogenase, DHA）试剂盒说明书

脱氢酶（dehydrogenase, DHA）试剂盒说明书

微量法100管/96样

注   意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

脱氢酶(dehydrogenase, DHA) 是一类催化物质氧化还原反应的酶，催化底物通过细胞色素系统被氧化，释放的能量供机体使用，是生物体取得能量的一种方式。

测定原理：

在细胞呼吸过程中，氢受体2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脱氢酶作用下接受氢以后，被还原为三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈现红色，于485nm测定其吸光值，即得脱氢酶活性。

自备实验仪器及用品：

筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸馏水、甲醇（不允许快递，请用户自备）。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存

试剂一：粉剂×1瓶，使用前加10mL试剂二溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：甲醇，自备。

样品处理：

1.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

2.        组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心20min。

3.        液体：直接检测。

测定步骤和操作表：

脱氢酶活力计算：

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

酶活单位定义：在37℃时，每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反总÷（Cpr×V样）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活单位定义：在37℃时，每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。

DHA（μg/ min /g 鲜重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W

3. 按液体体积计算

酶活单位定义：在37℃时，每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。

DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反总÷V样÷T= 0.181×（△A+0.0312）

V反总：反应总体积，1.1mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。

b. 用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0211x - 0.0312；R² = 0.9988；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

1.按照蛋白浓度计算

酶活单位定义：在37℃时，每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反总÷（Cpr×V样）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活单位定义：在37℃时，每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。

DHA（μg/ min /g 鲜重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W

3. 按液体体积计算

酶活单位定义：在37℃时，每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。

DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反总÷V样÷T= 0.362×（△A+0.0312）

V反总：反应总体积，1.1mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

配制好的试剂一避光保存于4℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。