葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）试剂盒说明书

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）试剂盒说明书

                                      微量法100管/48样

注   意 ：正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GOD（EC 1.1.3.4）广泛存在于动物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生H₂O₂，是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。

测定原理：

GOD催化产生H₂O₂，过氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在500 nm有特征吸收峰，颜色深浅与GOD活性成线性关系。

试验中所需的仪器和设备：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

缓冲液：液体30mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入10mL缓冲液充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一个月；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入10mL缓冲液充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一个月；

样品测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至500nm，蒸馏水调零。

2、   试剂一和试剂二的配制：参见试剂的组成和配制。

3、煮沸样本的准备：取200μL样本至新的EP管中，95℃水浴10min，冷却至室温后，8000g 4℃离心10min，取上清作为对照管的煮沸样本待测。

4、测定操作表

混匀，35'C保温15min后，于500nm波长处读取吸光度。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

GOD活力单位的计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

回归方程为y = 2.8348x - 0.0169；x为H₂O₂标准品浓度（μmol/mL），y为ΔA。

1、血清（浆）GOD活力的计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷V样÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)

2、细菌、细胞或组织GOD活力的计算

（1）按蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(V样×Cpr) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/g鲜重）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(W×V样÷V样总) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/10⁴ cell）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(500×V样÷V样总) ×1000÷T

=0.118×(ΔA+0.0169)

V反总：反应体系总体积，0.125mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

 b.用96孔板测定的计算公式如下

回归方程为y = 1.4174x - 0.0169；x为H₂O₂标准品浓度（μmol/mL），y为ΔA。

1、血清（浆）GOD活力的计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反总÷V样÷T×1000=118×(ΔA+0.0169)

2、细菌、细胞或组织GOD活力的计算

（1）按蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反总÷(V样×Cpr) ×1000÷T

=118×(ΔA+0.0169)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/g鲜重）=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反总÷(W×V样÷V样总) ×1000÷T

=118×(ΔA+0.0169)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol H₂O₂为一个酶活力单位。

GOD（nmol/min/10⁴ cell）=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反总÷(500×V样÷V样总) ×1000÷T

=0.235×(ΔA+0.0169)

V反总：反应体系总体积，0.125mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万