森林脑炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

森林脑炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

商品名称：森林脑炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Name     ：Forest Encephalitis Virus(SFV) SYBR qRT-PCR Kit

林脑炎病毒(Forest Encephalitis Virus，SFV)是一种RNA病毒，由蜱传播，在春夏季节流行于俄罗斯及我国东北森林地带，非疫区易感人被带病毒的蜱叮咬后，易感染发病，另外因喝生羊奶（羊感染时奶中带病毒或被蜱类污染）而被传染，约经8～14天潜伏期后发生脑炎，出现肌肉麻痹、wei缩、昏迷致死，少数痊yu者也常遗留肌肉麻痹。居住在森林疫区的发生脑炎，出现肌肉麻痹、wei缩、昏迷致死，少数痊yu者也常遗留肌肉麻痹。居住在森林疫区的人，因受少量病毒的隐性感染，血中有中和抗体，对病毒有免疫力，因此森林脑炎病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1.       一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2.      根据森林脑炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3.      基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。

4.      使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5.      本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

【试剂组成】

【储存条件及有效期】

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA片段作为阳性对照。

【自备试剂】样品RNA

【使用方法】

一、稀释阳性对照（以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1.       标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2.      在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3.      换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4.      换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5.      如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

       6.      用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

7.       如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。

8.      在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：

注:需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用ROX染料II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9.       上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

11.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。